...posant en pràctica el mètode Alpha-CAT TLC i el GC-FID
Per Sébastien Béguerie i Ignacio García
7a Conferència Internacional sobre els Cannabinoides en la Medicina
IACM, Colònia, Alemanya, 27-28 de setembre, 2013
Introducció
- El consum de Cànnabis medicinal està augmentant en tot el món, fet que intensifica la necessitat de prevenció per entendre els valors terapèutics dels cannabinoides i els potencials efectes secundaris. Per tant, és important comprovar cada matriu cannabinoide per a una dosificació correcta (Grant i Prof. Assoc., 2012).
- S’ha recomanat una gran varietat de metodologies per a la selecció de mostres de marihuana o plantes de Cànnabis: Cromatografia de capa fina (CCF), cromatografia laminar d’alt rendiment (OPLC), cromatografia líquida d’alta pressió (HPLC), cromatografia de gasos (GC) amb espectrometria de masses (MS), electrocromatografia capil·lar (CEC), mètode fluorimmunològic de resolució en el temps, immunoassaig, etc. La majoria d’aquestes tècniques requereixen instruments pesats de cost elevat, així com una gran quantitat de temps (Galand i Prof. Assoc., 2004).
- Cal assegurar el seguiment en la producció. L’Administració d’Aliments i Fàrmacs dels EUA (FDA) exigeix que totes les companyies alimentàries, farmacèutiques i nutricèutiques adherides s’abstinguin de realitzar proves amb matèria prima procedent del Cànnabis, i de facilitar informació sobre nivells de cannabinoides en productes derivats, deixant els pacients en una total obscuritat pel que fa al que estan ingerint o inhalant (Steve Kilts, 2012).
- S’ha realitzat semiquantificació per densitometria amb mètodes analítics CCF (Fischedick i Prof. Assoc., 2009).
- La CCF pot ser el millor mètode si l’objectiu és examinar un gran nombre de mostres simultàniament en una anàlisi visual ràpida. Al contrari del que ocorre en la comparació de dues mostres per decidir si són iguals (o diferents), quan cal una anàlisi quantitativa, la valoració de l’origen es qualitativa, doncs la mostra en observació i les mostres de referència són, de fet, diferents, per la qual cosa no té sentit utilitzar tecnologies més potents com l’HPLC, ja que la informació quantitativa subministrada podria causar confusió (Baker i Prof. Assoc., 1980).
- La CCF és un mètode d’anàlisi de cannabinoides de cost baix aprovat per l’Oficina de les Nacions Unides contra la Droga i el Delicte (ONUDD) per als controls rutinaris de contingut cannabinoide d’origen cannàbic (Secció de Laboratori i Afers Científics de l’ONUDD, 2009).
L’Alpha-CAT (prova d’anàlisi de cannabinoides) permet el mesurament de la concentració cannabinoide mitjançant el càlcul de l’índex de densitat de píxels per àrea en cadascun dels diferents rangs percentuals de concentració cannabinoide, amb els programes informàtics Photoshop i Excel. S’obté una corba de regressió que mostra una correlació lineal. De la corba de regressió de CBD, CBN, THC, THCV, CBG i CBC, es van dissenyar gràfics de calibratge d’àrees puntuals que servissin de regles de mesurament per tenir una manera manejable i visual de mesurar el percentatge d’acord amb la mida de la taca mostrada a la placa CCF.
Per verificar l’exactitud de la lectura del percentatge de cannabinoides amb els patrons d’Alpha-CAT es va realitzar un estudi cec comparatiu utilitzant l’instrument GC-FID, propietat de la Fundació CANNA, i l’equip Alpha-CAT, per a la quantificació de THC, CBD i CBN.
Materials i mètodes
Elements i protocols utilitzats en el GC-FID: 50 mg d’inflorescències seques i homogeneïtzades van ser extretes amb 2.000 μl de mescla metanol:cloroform en proporció 9:1 i 0,2 g/l de fenantrè, i les mostres van ser sotmeses a l’energia d’ultrasons (sonicació) en un bany ultrasònic. Una part alíquota de 200 μl de l’extracció va ser transferida a un vial de cromatografia amb 1.000 μl de metanol. El contingut cannabinoide va ser analitzat en un GC amb detector FID. La quantificació va ser realitzada utilitzant una corba de calibratge construïda utilitzant la ràtio de les àrees compreses en l’estàndard intern i diversos estàndards referents de concentració cannabinoide. Per al calibratge es va utilitzar CBN en lloc de THC. (Poortman van Der Meer i Prof. Assoc., 1999). El mètode permet una correcta separació dels cannabinoides CBD, CBC, THC, CBG i CBN.
Gràfic 1: resultats d’Alpha-CAT
Elements i protocols utilitzats en l’Alpha-CAT: 100 mg d’inflorescències seques i homogeneïtzades van ser extretes amb una mescla de dissolvent, que anomenarem “líquid d’assaig”, durant 2 minuts, i van ser passades a una placa amb recobriment de gel de sílice (TLC F254) de 5x10 cm, amb un tub capil·lar de 2 μl. La decarboxilació es va assolir a 150 ºC durant 40 segons utilitzant l’escalfador i l’eina d’ajustament d’Alpha-CAT. La quantificació va ser realitzada a través de la lectura dels percentatges corresponents de cannabinoides utilitzant les regles de mesurament de cannabinoides d’Alpha-CAT ((imatge 1)).
Per a aquest estudi comparatiu es van utilitzar quatre lots homogeneïtzats de varietats de Cànnabis diferents. Es van analitzar tres mostres de cada lot amb el mètode del TLC i tres més amb el del GC-FID. Els procediments de laboratori van tenir lloc a les instal·lacions de CF, i els resultats del TLC es van sotmetre a un estudi cec realitzat amb imatges de planxes escanejades enviades al correu electrònic de la seu dels laboratoris Alpha-CAT per a una lectura Alpha-CAT de la quantificació de cannabinoides amb les regles de mesura corresponents.
Imatge 1: Mètode de densitometria d’Alpha-CAT utilitzant el calibratge percentual de cannabinoides Alpha-CAT
Discussió de resultats
Es van comparar els percentatges mitjans de cada mostra. Les diferències resultants de la comparativa dels dos mètodes es van situar entre un 15,40% i un 48,82% en quantificar el THC, i un 34,25% en quantificar el CBD. La proporció THC:CBB va ser comparable proporcionalment. Els casos en què el CBD i el CBN se situaven per sota de l’1% donaven lloc a una incoherència en termes de quantificació, malgrat haver estat detectats correctament. Aquesta va ser la primera comparativa directa entre els protocols GC-FID i TLC Alpha-CAT.
Imatge 2: Pics màxims d’identificació i quantificació de cannabinoides de GC-FID
El mètode d’anàlisi Alpha-CAT ha demostrat ser una eina qualitativa vàlida per a la detecció de cannabinoides, que ofereix resultats reproduïbles. No obstant això, només tècnics experimentats en el mètode Alpha-CAT poden obtenir resultats semiquantitatius utilitzant les regles de mesurament de nivells de cannabinoides d’Alpha-CAT. Anàlisis cromatogràfiques líquides i de gasos són necessàries per a una quantificació precisa dels cannabinoides i altres compostos actius secundaris presents al Cànnabis.
Gràfic 2: resultats GC-FIC
Referències
- Igor Grant, Hampton Atkinson, Ben Gouaux, y Barth Wilsey. Medical Marijuana: Clearing Away the Smoke. Open Neurol J. 2012; 6: p. 18–25.
- Galand N, Ernouf D, Montigny F. Separation and identification of Cannabis components by different planar chromatography techniques (TLC, AMD, OPLC). J Chromatogr Sci. 2004 Mar; 42(3) : p.130-134.
- Steve Kilts, vice president of CannLab, Denver, CO, USA. Industry Needs to Start Taking Medical Cannabis Testing, Labeling Seriously. Medical Marijuana Business Daily, www.mmjbusinessdaily.com, 2nd of October 2012.
- Justin T Fischedick, Ronald Glas, Arno Hazekamp, Rob Verpoorte. A qualitative and quantitative HPTLC densitometry method for the analysis of cannabinoids in Cannabis sativa L. Phytochem Anal. 2009; 20(5): p.421-426.
- P. B. Baker, T. A. Gough, B. J. Taylor. Illicitly imported Cannabis products: some physical and chemical features indicative of their origin. Bulletin UNODC. 1980, p.31-40.
- Sección de Laboratorio y Asuntos Científicos de la ONUDD, Recommended Methods for the Identification and Analysis of Cannabis and Cannabis Products, United Nations, publications 2009, p.36-39.
- Poortman-van der Meer, A.J. y Huizer, H. A contribution to the improvement of accuracy in the quantitation of THC. Forensic Sci int 1999. 101, 1-8
