..pomocí metody alfa-CAT TLC a GC-FID
Sébastien Béguerie & Ignacio García
7th mezinárodní konference o kanabinoidech v medicíně
IACM, Kolín nad Rýnem, Německo, 27.-28. září 2013
Úvod
- Spotřeba léčebného konopí na celém světě roste, což zdůrazňuje potřebu prevence rizik, aby bylo možné porozumět terapeutickým hodnotám kanabinoidů a jejich možným vedlejším účinkům. Tím se stává důležité testovat každou matrici kanabinoidů z hlediska jejich dávkování (Grant a kol., 2012).
- Pro stanovení vzorků marihuany nebo rostlin konopí byla doporučena celá řada metodik: V této oblasti se používají následující metody: tenkovrstvá chromatografie (TLC), optimálně výkonná laminární chromatografie (OPLC), vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC), plynová chromatografie (GC) s hmotnostní spektrometrií (MS), kapilární elektrochromatografie, časově rozlišená fluoroimunologická metoda, imunoanalýza atd.... Většina těchto technik vyžaduje těžké a nákladné přístroje a mnoho času (Galand et al, 2004).
- Je nutné zajistit sledovatelnost ve výrobě. Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) vyžaduje, aby všechny farmaceutické, nutraceutické a potravinářské společnosti, které se k němu hlásí, netestovaly suroviny z léčebného konopí a neposkytovaly informace o dávkování kanabinoidů u odvozených produktů, takže pacienti nejsou informováni o tom, co vdechují nebo požívají. (Steve Kilts, 2012).
- Byla provedena semikvantifikace pomocí denzitometrie s metodami TLC analýzy (Fischedick et al, 2009).
- TLC může být metodou volby, pokud je cílem provést velký počet vzorků rychle, vizuálně a současně. Na rozdíl od porovnání dvou vzorků za účelem posouzení, zda jsou stejné (nebo odlišné), kdy je podstatná kvantitativní analýza, je posouzení původu kvalitativní, protože zkoumaný vzorek a referenční vzorky jsou ve skutečnosti odlišné. Nemá tedy smysl používat výkonnější techniky, jako např.
- HPLC, protože poskytnuté kvantitativní informace mohou obraz zmást (Baker et al, 1980).
- TLC je levná metoda pro analýzu kanabinoidů, kterou schválil Úřad OSN pro drogy a kriminalitu (UNODC) pro rutinní analýzu konopí.
- kontrolu obsahu kanabinoidů a původu konopí (Laboratory and Scientific Section UNODC, 2009).
Alpha-CAT (Cannabinoid Analysis Test) umožňuje kalibraci kanabinoidní skvrny pomocí poměru počtu pixelů/povrchové plochy v každém rozsahu % kanabinoidů pomocí počítačových programů Photoshop a Excel. Získá se regresní křivka, která vykazuje lineární korelaci. Z regresní přímky CBD, CBN, THC, THCV, CBG a CBC byly navrženy kalibrační grafy plochy skvrny jako pravítka, aby bylo možné pohodlně a vizuálně měřit % podle velikosti skvrny odhalené na TLC desce.
Aby se ověřilo, jak přesně lze pomocí pravítek alfa-CAT odečíst % kanabinoidů, byla provedena slepá srovnávací studie s použitím přístroje GC-FID, který je majetkem společnosti Fundación CANNA, a TLC soupravy alfa-CAT pro kvantifikaci THC, CBD a CBN.
Materiály a metody
Podmínky GC-FID: 50 mg sušených a homogenizovaných květenství bylo extrahováno 2000 μl směsi methanol:chloroform v poměru 9:1 a 0,2 g/l fenanthrenu a vzorky byly sonikovány 15 minut v ultrazvukové lázni. Alikvotní část 200 μl extrakce byla převedena do chromatografické lahvičky s 1000 μl methanolu. Obsah kanabinoidů byl analyzován v GC s FID detektorem. Kvantifikace byla provedena pomocí kalibrační křivky, která byla sestrojena na základě poměru ploch mezi vnitřním standardem a různými koncentracemi referenčních standardů kanabinoidů. Pro kalibraci byl místo THC použit CBN (Poortman van Der Meer et al, 1999). Metoda umožňuje dobré oddělení kanabinoidů CBD, CBC, THC, CBG a CBN.
Graf 1: Výsledky alfa-CAT
Podmínky alfa-CAT: 100 mg sušených a homogenizovaných květenství bylo extrahováno směsí rozpouštědel, která se bude nazývat "testovací kapalina", po dobu 2 minut a bylo přeneseno pomocí 2 μl kapilární zkumavky na desku 5x10 cm předem pokrytou silikagelem (TLC F254). Dekarboxylace bylo dosaženo při teplotě 150 °C po dobu 40 sekund pomocí ohřívacího zařízení alfa-CAT a nástroje pro vyrovnávání. Destičky byly vyvolány a obarveny pomocí solného barviva Fast Blue B. Kvantifikace byla provedena odečtením odpovídajících procent kanabinoidů pomocí pravítek alfa-CAT pro kanabinoidy. (obrázek1).
Pro tuto srovnávací studii byly použity 4 homogenizované šarže různých odrůd konopí. Z každé šarže byly 3 vzorky analyzovány pomocí TLC a 3 pomocí GC/FID. Laboratorní postupy byly provedeny na místě CF a výsledky TLC byly testovány naslepo, přenášeny pomocí snímků desek do e-mailu vedoucího laboratoře alfa-CAT pro kvantifikaci kanabinoidů odečtem alfa-CAT s odpovídajícími pravítky kanabinoidů.
Obrázek 1: metoda denzitometrie alfa-CAT s použitím kalibrace kanabinoidů alfa-CAT %.
Diskuse
Byly porovnány průměrné procentuální hodnoty jednotlivých vzorků. Při porovnání obou metod byly zjištěny rozdíly mezi 15,40 % a 48,82 % při kvantifikaci THC a 34,25 % při kvantifikaci CBD. Poměr THC:CBD byl proporcionálně srovnatelný (graf 2). Při hodnotách CBD a CBN pod 1 % došlo k nesouladu z hlediska kvantifikace, přestože byly detekovány správně. Toto byla první přímá srovnávací studie mezi GC-FID a protokolem TLC alfa-CAT.
Obrázek 2: Identifikační a kvantifikační píky kanabinoidů GC-FID
Testovací metoda Alpha-CAT se ukázala jako platný kvalitativní nástroj pro detekci kanabinoidů a poskytuje reprodukovatelné výsledky. Pouze technici dobře vyškolení v metodě soupravy alpha-CAT však mohou získat semikvantitativní výsledky pomocí kanabinoidních pravítek alpha-CAT. Pro přesnou kvantifikaci kanabinoidů a dalších důležitých sekundárních aktivních látek přítomných v konopí je třeba použít plynovou nebo kapalinovou chromatografickou analýzu.
Graf 2: Výsledky GC-FIC
Odkazy
- Igor Grant, Hampton Atkinson, Ben Gouaux, and Barth Wilsey. Medical Marijuana: Clearing Away the Smoke. Open Neurol J. 2012; 6: p. 18–25.
- Galand N, Ernouf D, Montigny F. Separation and identification of Cannabis components by different planar chromatography techniques (TLC, AMD, OPLC). J Chromatogr Sci. 2004 Mar; 42(3) : p.130-134.
- Steve Kilts, vice president of CannLab, Denver, CO, USA. Industry Needs to Start Taking Medical Cannabis Testing, Labeling Seriously. Medical Marijuana Business Daily, www.mmjbusinessdaily.com, 2nd of October 2012.
- Justin T Fischedick, Ronald Glas, Arno Hazekamp, Rob Verpoorte. A qualitative and quantitative HPTLC densitometry method for the analysis of cannabinoids in Cannabis sativa L. Phytochem Anal. 2009; 20(5): p.421-426.
- P. B. Baker, T. A. Gough, B. J. Taylor. Illicitly imported Cannabis products: some physical and chemical features indicative of their origin. Bulletin UNODC. 1980, p.31-40.
- Laboratory and Scientific Section UNODC, Recommended Methods for the Identification and Analysis of Cannabis and Cannabis Products, United Nations, publications 2009, p.36-39.
- Poortman-van der Meer, A.J. and Huizer, H. A contribution to the improvement of accuracy in the quantitation of THC. Forensic Sci int 1999. 101, 1-8
