...par la méthode CCM alpha-CAT et CPG-FID
Par Sébastien Béguerie & Ignacio García
7e conférence internationale sur les cannabinoïdes en médecine
IACM, Cologne, Allemagne, 27-28 septembre 2013
Introduction
- La consommation de cannabis médicinal augmente partout dans le monde, ce qui souligne la nécessité de la prévention des risques pour comprendre les valeurs thérapeutiques et les effets secondaires potentiels des cannabinoïdes. Il devient donc important de tester le dosage de chaque matrice de cannabinoïdes (Grant and al., 2012).
- Une grande diversité de méthodologies a été recommandée pour la détermination des échantillons de marijuana ou des plantes de cannabis : chromatographie sur couche mince (CCM), chromatographie laminaire à performance optimale (OPLC), chromatographie liquide à haute pression (CLHP), chromatographie en phase gazeuse (CPG) avec spectrométrie de masse (MS), électrochromatographie capillaire, méthode fluoro-immunologique à résolution temporelle, immunoessai, etc. La plupart de ces techniques nécessitent des instruments lourds et coûteux et beaucoup de temps (Galand et al, 2004).
- Il est obligatoire de garantir la traçabilité de la production. La Food and Drug Administration (FDA) exige que toutes les entreprises pharmaceutiques, nutraceutiques et alimentaires qui y adhèrent ne testent pas les matières premières du cannabis médical ou ne fournissent pas d'informations sur le dosage des cannabinoïdes des produits dérivés, laissant les patients dans l'ignorance de ce qu'ils inhalent ou ingèrent (Steve Kilts, 2012).
- Une semi-quantification par densitométrie avec des méthodes d'analyse CCM a été réalisée (Fischedick et al, 2009).
- La CCM peut être la méthode de choix si l'objectif est de traiter un grand nombre d'échantillons de manière rapide, visuelle et simultanée. Contrairement à la comparaison de deux échantillons afin d'évaluer s'ils sont identiques (ou différents), lorsqu'une analyse quantitative est indispensable, l'évaluation de l'origine est qualitative, puisque l'échantillon étudié et les échantillons de référence sont, en fait, différents. Il ne sert donc pas à grand-chose d'utiliser des techniques plus puissantes telles que la méthode CLHP car les informations quantitatives fournies risquent de brouiller la caractéristique dominante (Baker et al, 1980).
- La CCM est une méthode peu coûteuse pour l'analyse des cannabinoïdes et approuvée par l'Office des Nations unies contre les drogues et le crime (ONUDC) pour le contrôle de routine de la teneur en cannabinoïdes et de l'origine du cannabis (Laboratory and Scientific Section UNODC, 2009).
La méthode Alpha-CAT (Cannabinoid Analysis Test) permet de calibrer la tache de cannabinoïde en prenant le rapport entre le nombre de pixels et la surface dans chaque plage de % de cannabinoïdes en utilisant les programmes Photoshop et Excel. On obtient une courbe de régression qui a fait apparaître une corrélation linéaire. À partir de la ligne de régression de CBD, CBN, THC, THCV, CBG et CBC ; les tableaux de calibrage de la zone du point ont été conçus comme des règles afin d'avoir un moyen pratique et visuel de mesurer le % en fonction de la taille du point révélé sur la plaque CCM.
Afin de vérifier la précision avec laquelle le pourcentage de cannabinoïdes peut être lu avec les règles de l'alpha-CAT, une étude comparative en aveugle a été réalisée en utilisant l'appareil GC-FID, propriété de la Fundación CANNA et le kit CCM alpha-CAT pour la quantification du THC, du CBD et du CBN.
Matériels et méthodes
Conditions CPG-FID : 50 mg d'inflorescences séchées et homogénéisées ont été extraites avec 2 000 μl d'un mélange 9:1 méthanol-chloroforme et 0,2 g/l de phénanthrène et les échantillons ont été passés pendant 15 minutes dans un bain ultrasonique. Une fraction de 200 μl de l'extraction a été transférée dans un flacon de chromatographie contenant 1 000 μl de méthanol. La teneur en cannabinoïdes a été analysée par CPG avec détecteur FID. La quantification a été effectuée à l'aide d'une courbe d'étalonnage qui a été construite en utilisant le rapport des surfaces entre l'étalon interne et diverses concentrations d'étalons de référence de cannabinoïdes. Le CBN a été utilisé au lieu du THC pour l'étalonnage (Poortman van Der Meer et al, 1999). La méthode permet une bonne séparation des cannabinoïdes CBD, CBC, THC, CBG et CBN.
Graphique 1 : résultats alpha-CAT
Conditions alpha-CAT : 100 mg d'inflorescences séchées et homogénéisées ont été extraites avec un mélange de solvants qui sera appelé « fluide test » pendant 2 minutes et a été transféré avec un tube capillaire de 2 μl sur une plaque de gel de silice pré-enrobé de 5 x 10 cm (TLC F254). La décarboxylation a été réalisée à 150 °C pendant 40 secondes à l'aide du dispositif de chauffage et de l'outil d'alignement de l'alpha-CAT. Les plaques ont été développées et colorées en utilisant le colorant salin Fast Blue B. La quantification a été effectuée en lisant les pourcentages de cannabinoïdes correspondants à l'aide de règles de cannabinoïdes alpha-CAT. (picture1).
4 lots homogénéisés de différentes variétés de cannabis ont été utilisés pour cette étude comparative. 3 échantillons de chaque lot ont été analysés par CCM et 3 par CPG/FID. Les procédures de laboratoire ont été effectuées sur le site CF et les résultats de la CCM ont été testés en aveugle, puis transmis par balayage d'images de plaques au courriel du siège du laboratoire alpha-CAT pour la quantification des cannabinoïdes, lisant l'alpha-CAT avec ses règles correspondantes.
Photo 1 : méthode de densitométrie alpha-CAT, utilisant le pourcentage de calibrage alpha-CAT des cannabinoïdes
Discussion
Les pourcentages moyens de chaque échantillon ont été comparés. Comparant les deux méthodes, des différences entre 15,40 % et 48,82 % ont été détectées dans la quantification du THC et 34,25 % dans celle du CBD. Le rapport THC/CBD était proportionnellement comparable (Graphique 2). Lorsque le CBD et le CBN étaient inférieurs à 1 %, il y avait une incohérence en termes de quantification, même s'ils étaient correctement détectés. Il s'agissait de la première étude comparative directe entre le CPG-FID et le protocole alpha-CAT du TLC.
Photo 2 : Pics d'identification et de quantification des cannabinoïdes par CPG-FID
La méthode de test alpha-CAT s'est révélée être un outil qualitatif valable pour la détection des cannabinoïdes et donne des résultats reproductibles. Cependant, seuls des techniciens bien formés à la méthode du kit alpha-CAT peuvent obtenir des résultats semi-quantitatifs en utilisant les règles des cannabinoïdes de l'alpha-CAT. L'analyse par chromatographie en phase gazeuse ou liquide doit être utilisée pour quantifier précisément les cannabinoïdes et d'autres composés actifs secondaires importants présents dans le cannabis.
Graphique 2 : résultats CPG-FIC
Références
- Igor Grant, Hampton Atkinson, Ben Gouaux, and Barth Wilsey. Medical Marijuana: Clearing Away the Smoke. Open Neurol J. 2012; 6: p. 18–25.
- Galand N, Ernouf D, Montigny F. Separation and identification of Cannabis components by different planar chromatography techniques (TLC, AMD, OPLC). J Chromatogr Sci. 2004 Mar; 42(3) : p.130-134.
- Steve Kilts, vice president of CannLab, Denver, CO, USA. Industry Needs to Start Taking Medical Cannabis Testing, Labeling Seriously. Medical Marijuana Business Daily, www.mmjbusinessdaily.com, 2nd of October 2012.
- Justin T Fischedick, Ronald Glas, Arno Hazekamp, Rob Verpoorte. A qualitative and quantitative HPTLC densitometry method for the analysis of cannabinoids in Cannabis sativa L. Phytochem Anal. 2009; 20(5): p.421-426.
- P. B. Baker, T. A. Gough, B. J. Taylor. Illicitly imported Cannabis products: some physical and chemical features indicative of their origin. Bulletin UNODC. 1980, p.31-40.
- Laboratory and Scientific Section UNODC, Recommended Methods for the Identification and Analysis of Cannabis and Cannabis Products, United Nations, publications 2009, p.36-39.
- Poortman-van der Meer, A.J. and Huizer, H. A contribution to the improvement of accuracy in the quantitation of THC. Forensic Sci int 1999. 101, 1-8
