Dopo la scoperta dei virus negli ultimi anni del XIX secolo, per quasi 100 anni biologi e filosofi hanno discusso se essi fossero la più piccola forma di vita conosciuta dall'umanità.
Con un ciclo di vita strettamente parassitario, i virus possono infettare animali, piante, funghi e batteri. Si diffondono da una cellula ospite all'altra, e da un organismo ospite all'altro, e persino attraverso le specie; sono in grado di trasformarsi ed evolversi per aumentare le loro possibilità di creare un'altra generazione.
Per molti anni, i virus sono stati considerati il paradigma di un DNA/RNA programmato per la propria sopravvivenza. Un virus "possiede" e copia, in modo rozzo ed efficace, un frammento molto piccolo di materiale genetico, anche solo 3500 nucleotidi (come nel batteriofago MS2), che serve per codificare le proteine (spesso enzimi) necessarie a sottomettere il metabolismo cellulare dell'ospite, infettare le cellule vicine e replicare il virus, distruggendo la cellula ospite.
La comprensione dei genomi e del metabolismo dei virus è iniziata veramente negli anni '50 ed è progredita a grande velocità. Oggi, gli scienziati possono manipolare i virus in modo altamente raffinato: possono codificare i genomi su richiesta, e gestire la vita del virus come un burattinaio gestisce un burattino.
L'unica certezza che gli scienziati avevano da perdere, l'unico piccolo difetto del dibattito filosofico dei primi decenni del XX secolo, è che anche se i virus potessero essere considerati forme di vita, non sono i più piccoli conosciuti. Nel 1971 Theodor O. Diener (del Dipartimento di Agricoltura del governo statunitense, Beltsville, Maryland, U.S.) ha scoperto il primo viroide, l'agente causale di una malattia che colpisce il tubero fusiforme della patata. Diener ha dimostrato che l'agente è un RNA libero di 359 nucleotidi, troppo piccolo per contenere l'informazione genetica necessaria all'autoreplicazione, e incapace di sintetizzare un guscio.
VIROIDI
I viroidi, i più piccoli agenti infettivi conosciuti, appartengono al nuovo ordine degli agenti sub-virali, che attualmente comprende due famiglie, otto generi e 32 specie di viroidi. I virus e i viroidi non devono essere confusi tra loro, aggiungendo un altro livello di complessità al mondo microscopico.
Se vogliamo cercare delle analogie, i virus possono essere descritti come "hacker cellulari". Dopo l'iniezione del loro materiale genetico, i virus si impadroniscono della macchina cellulare, iniziano a sintetizzare i propri enzimi e proteine, e inducono sia l'autoreplicazione che l'infezione delle cellule vicine. Questi hacker ancestrali sono ben protetti da un capside, un guscio indurito fatto di proteine che è responsabile della specificità del virus. I capsidi danno ai virus la loro forma osservabile, trasportano i virus durante la loro migrazione negli organismi, e agiscono come sensori per identificare specifiche membrane cellulari come bersagli. All'interno del capside, il vero algoritmo infettivo è codificato come DNA/RNA, una specie di pistola carica.
I viroidi sono diversi. I viroidi sono dei mutaforma. Caratterizzati e modellati solo dal materiale genetico (RNA), i viroidi sono strutture nude che interagiscono con l'ambiente. La natura, l'orientamento e la forza dell'interazione con i composti vicini possono modificare le geometrie del viroide, che può adattarsi a un gran numero di ambienti chimici.
Con meno di un decimo delle nucleobasi RNA totali di un virus, le sequenze dei viroidi non codificano proteine o enzimi. Il materiale genetico di un viroide è fatto per essere un passepartout: capace di torcersi, allungarsi, piegarsi e dividersi in modo reversibile. La chiave per comprendere la replicazione dei viroidi è accettare che l'armonia caotica che definisce la biologia cellulare possa essere disturbata da una singola struttura.
Il Vd-RNA è un breve frammento circolare di circa 246-401 nucleotidi, con un grado molto alto di appaiamento delle basi. Il ciclo di vita di alcuni viroidi è caratterizzato da un ritardo tra l'infezione della pianta e la comparsa di sintomi visibili, e quindi prestano il loro nome alla condizione.
Un esempio di questo comportamento, e l'obiettivo di questo capitolo, è il viroide latente del luppolo (HLVd), un membro della famiglia Pospiviroidae e del genere dei Cocadviroidi.
HLVd
Fig.1 Schema termodinamico stabile originale dell'HLV, come pubblicato in Nucleic Acids Research nel 1988
L'HLVd consiste in un polimero a singolo filamento di 256 nucleotidi che assumono una struttura simile a quella di un'asta con un grado di basi appaiate del 65,5%. Come discusso nel capitolo precedente, HLVd è caratterizzato da una discreta infezione del luppolo, come suggerisce il nome, e della cannabis. Il viroide latente del luppolo provoca una risposta immunitaria che si traduce in necrosi, ingiallimento e morte cellulare.
L'osservazione e la caratterizzazione dell'HLVd nella cannabis risale a pochi anni fa ed è attribuita a Graham Farrar di Glass House Farms con indagini scientifiche fornite dall'Università della California, Davis, in collaborazione con Phylos Bioscience (come partner privato). Nel 2017, i sintomi dell'HLVd sono stati notati per la prima volta in California, e il viroide è ora presente in Canada. Le piante possono essere portatrici latenti asintomatiche.
Sintomi dell'HLVd
Una pianta con HLVd mostra una serie di strani sintomi: arresto della crescita, steli fragili, scarsa fioritura ed espressione di strutture secondarie e metaboliti, e malformazione e/o clorosi delle foglie, senza una causa evidente.
Il periodo di latenza tra l'infezione della pianta e la comparsa dei primi sintomi non può essere attribuito a un unico fattore determinante e può variare molto tra diversi chemiotipi.
I dati raccolti da diversi studi sembrano indicare che gli individui giovani sono più efficaci nel riconoscere/combattere frammenti di RNA estranei come i viroidi, generando il ritardo che noi razionalizziamo come latenza.
Gli studi sull'HLVd ci stanno lentamente rivelando le cause del dudding, e fornendo protocolli e soluzioni per mitigare la diffusione mondiale del patogeno.
Per prima cosa, il dudding altera il rapporto crescita/difesa delle piante infette, il che significa un ritardo generalizzato dei tempi di crescita e inerzia nei confronti delle modifiche delle condizioni di crescita. Quest'ultimo effetto include le reazioni ai nutrienti, agli additivi e al fotoperiodo.
Il secondo, e sempre più preoccupante, effetto è sulle strutture primarie e secondarie come fiori/frutti e filamenti/spine. Per le piante di cannabis infettate da HLVd, questo significa una drastica riduzione del numero di tricomi e la malformazione dei tricomi rimanenti in strutture simili a peli secchi. Gli effetti dell'infezione sulle moderne coltivazioni di cannabis non sono confermati, ma sono stimati tra il 30% e l'80% di perdita sulla resa delle unità infette. Questo numero non è mitigato dall'esistenza di una cura per le piante viventi; gli individui infetti da HLVd vengono immediatamente distrutti.
Conoscendo i pericoli rappresentati da questo agente patogeno, gli scienziati stanno sviluppando tecniche per combattere il viroide a livello cellulare e possono generare una prole sana da un ospite infetto con diverse tecniche come la termoterapia, la terapia del freddo, la coltura dei tessuti, il microinnesto in vitro o la crioterapia, a seconda della specifica coppia viroide-ospite.
Trasmissione e precauzioni
Il recupero di materiale genetico pulito da campioni contaminati è più difficile di quanto possa sembrare: l'HLVd può sopravvivere per lunghi periodi al di fuori delle cellule viventi, ed è stato dimostrato che anche tessuti morti possono diffondere la malattia.
Il rischio di dover sacrificare una grossa proporzione di piante già cresciute è sufficientemente preoccupante da raccomandare protocolli igienici rigorosi. L'uso di ambienti interni sterili, guanti e utensili monouso, e il corretto isolamento biologico delle piante di cannabis sono stati raccomandati da tutta la comunità scientifica fin dall'inizio del "rinascimento" della cannabis, ma le minacce in arrivo trasformeranno questa raccomandazione in un obbligo. Una soluzione di candeggina al 10% o la sterilizzazione su fiamma o bruciatore Bunsen sono sistemi prudenti per prevenire/evitare il contagio tramite utensili riutilizzabili, limitando le spese relative ai materiali monouso.
La diffusione dell'HLVd nella cannabis attraverso i semi è meno comune, ma non può ancora essere esclusa. I semi devono essere considerati come piccoli "caveau" per le strutture di DNA, e sono tra gli ambienti più ostili al materiale genetico estraneo, impedendo l'accumulo del patogeno. L'esterno dei semi potrebbe ancora portare residui e altri frammenti che possono agire come vettori di viroidi; un trattamento attento (lavaggio) è consigliato per ridurre ulteriormente il rischio.
Gli studi sull'HLVd nel luppolo sembrano escludere il contagio attraverso gli insetti, ma i dati devono ancora essere verificati sulle varianti della cannabis.
I piccoli coltivatori privati dovrebbero sentirsi relativamente protetti: spazi interni puliti, spesso con meno di 10 individui, selezionati da poche decine di semi o tagli germinati, tendono a minimizzare i rischi di contagio sia da pianta a pianta che da utensile a pianta.
Su scala più grande, la frammentazione delle aree di coltivazione in unità più piccole e la restrizione/registrazione dei punti di accesso da/a spazi di coltivazione/lavoro è un consiglio NBP (Norme di Buona Preparazione) che non dovrebbe essere trascurato.
Come per molti altri patogeni, il modo migliore per garantire una risposta rapida all'HLVd è un solido programma di analisi. I laboratori di tutto il mondo sono capaci di identificare e persino sequenziare l'HLVd e altri viroidi/virus con tecniche di routine a prezzi competitivi.
Il test PCR a trascrizione inversa (RNA Polymerase Chain Reaction) sta dominando l'offerta per campioni commerciali. La tecnica amplifica le sequenze di RNA nel campione e, dopo alcuni passaggi, identifica i frammenti noti (sequenze e frammenti di viroidi) con alta precisione, permettendo una diagnosi precoce.
Anche il sequenziamento dell'RNA è una possibilità: l'intero materiale RNA presente nelle cellule viene amplificato, i frammenti naturali vengono scartati e quelli rimanenti analizzati in dettaglio.
I prezzi dei laboratori provati stanno diminuendo rapidamente, ma le stesse tecniche possono essere eseguite in-house, con apparecchiature specifiche.
Anche se hanno solo pochi metodi robusti a loro disposizione, gli scienziati stanno sviluppando molte nuove tecniche per accelerare e semplificare il rilevamento dell'HLVd su ampia scala. In ogni caso, possono essere necessari più campioni per pianta per determinare con certezza che la pianta è esente da viroidi.
Per diagnosticare efficacemente che una pianta non è malata, alcuni laboratori raccomandano un minimo di 3-4 test per pianta, con ogni test preso a 1-2 settimane di distanza.
I coltivatori devono stare particolarmente attenti alle piante madri. Generalmente, occorre inviare i campioni durante la notte e sotto ghiaccio.
Se una coltura risulta positiva all'HLVd, la genetica selezionata può ancora essere salvata. Laboratori e aziende private hanno sviluppato e brevettato tecniche proprietarie per combattere l'accumulo di viroidi in tessuti specifici.
Trattamenti a caldo e/o a freddo vengono generalmente utilizzati su colture di tessuti meristematici o nodali per pulire il campione. Le cellule di tessuto vegetale così pulite vengono poi coltivate su terreni di crescita specializzati e propagate per creare germogli radicati senza malattie, chiamati "piantine" (anche conosciuta come micropropagazione).
Il più grande svantaggio di queste procedure è il prezzo, che può raggiungere le migliaia di dollari.
Conclusioni
Virus e viroidi, come l'HLVd, non cesseranno di esistere solo perché il mercato della cannabis si sta focalizzando su argomenti più comuni. La Fundación CANNA è consapevole dei rischi legati all'HLVd che emergeranno quando globalizzazione e pratiche illecite diffonderanno il patogeno, e ha già reagito.
Chiedi aiuto a info@fundacion-canna.com!
Bibliografia e ringraziamenti
Un ringraziamento speciale all'orticoltore Abha Gupta per il meraviglioso supporto nella formulazione finale di questo articolo.
Gergerich, R.C., and V. V. Dolja. Introduction to Plant Viruses, the Invisible Foe. The Plant Health Instructor. 2006 DOI: 10.1094/PHI-I-2006-0414-01
Patzak, J.; Henychová, A.;Krofta, K.; Svoboda, P.; Malíˇrová, I. The Influence of Hop Latent Viroid (HLVd) Infection on Gene Expression and Secondary Metabolite Contents in Hop (Humulus lupulus L.) Glandular Trichomes. Plants 2021, 10, 2297. https://doi.org/10.3390/plants10112297
Holger Puchta, Karla Ramm and Heinz L.Sanger. The molecular structure of hop latent viroid (HLVd), a new viroid occurring worldwide in hops; Accession no. X07397 Max-Planck-Institut fuir Biochemie, April 18, 1988
Marina Barba, Zhibo Zhang. Viroid Elimination by Thermotherapy, Cold Therapy, Tissue Culture, In Vitro Micrografting, or Cryotherapy:, in Viroids and Satellites, 2017
