...met behulp van de alpha-CAT TLC-methode en GC-FID
Door Sébastien Béguerie & Ignacio García
7e internationale conferentie over cannabinoïden in de geneeskunde
IACM, Keulen, Duitsland, 27-28 september 2013
Inleiding
- Over de hele wereld neemt het gebruik van medicinale cannabis toe. Met het oog op het voorkomen van risico's, wordt het daarom steeds noodzakelijker om de therapeutische waarden en mogelijke bijwerkingen van cannabinoïden te begrijpen. Het is daarom belangrijk om elke cannabinoïdematrix te testen op de dosering (Grant et al., 2012).
- Een breed scala aan methodologieën wordt aanbevolen voor het bepalen van marihuanamonsters of cannabisplanten: dunnelaagchromatografie (TLC), optimaal presterende laminaire chromatografie (OPLC), hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), gaschromatografie (GC) met massaspectometrie (MS), capillaire elektrochromatografie, tijdsopgeloste fluor-immunologische methode, immuniteitstest, enz. Voor het merendeel van deze technieken zijn zware en dure instrumenten nodig, naast veel tijd (Galand et al, 2004).
- Het is verplicht om tijdens de productie de traceerbaarheid te garanderen. De Amerikaanse FDA (Food and Drug Administration) vereist dat alle farmaceutische-, nutraceutische- en levensmiddelenproducenten die de voorschriften naleven geen medische cannabisgrondstoffen mogen testen of cannabinoïdoseringsinformatie van afgeleide producten verstrekken, waardoor patiënten in het duister tasten over wat ze inhaleren of binnenkrijgen (Steve Kilts, 2012).
- Semi-kwantificering is uitgevoerd via densitometrie met TLC-analysemethoden (Fischedick et al, 2009).
- TLC kan de voorkeursmethode zijn als het doel is om een groot aantal monsters snel, visueel en gelijktijdig te verwerken. Terwijl bij de vergelijking van twee monsters moet worden nagegaan of ze hetzelfde zijn (of verschillend), waarbij een kwantitatieve analyse onontbeerlijk is, is de beoordeling van de oorsprong kwalitatief, aangezien het bestudeerde monster en de referentiemonsters in feite verschillend zijn. Het heeft dus weinig zin om krachtigere technieken toe te passen, zoals HPLC, aangezien de kwantitatieve informatie die het oplevert waarschijnlijk eerder verwarrend zal zijn (Baker et al, 1980)
- TLC is een goedkope methode om cannabinoïden te analyseren en het is goedgekeurd door het Bureau van de Verenigde Naties voor drugs- en misdaadbestrijding (UNODC) om routinematig de inhoud en oorsprong van cannabinoïden te controleren (UNODC laboratorium en wetenschappelijke afdeling, 2009).
Met Alpha-CAT (Cannabinoid Analysis Test) kan de cannabinoïdenvlek worden gekalibreerd door de verhouding pixeltelling/oppervlakte te berekenen binnen elk cannabinoïde %-bereik met behulp van de computerprogramma's Photoshop en Excel. Er wordt een regressiecurve verkregen die een lineaire correlatie vertoonde. Uit de regressielijn van CBD, CBN, THC, THCV, CBG en CBC werden ijkgrafieken voor het vlekoppervlak ontworpen als meetlatten om een handige en visuele manier te hebben om het percentage te meten volgens de vlekgrootte die op de TLC-plaat te zien is.
Om te controleren hoe nauwkeurig het percentage cannabinoïden kan worden gelezen met behulp van de alpha-CATmeetlatten werd een blinde vergelijkende studie uitgevoerd met gebruik van het GC-FID-apparaat, eigendom van de CANNA stichting, en de alpha-CAT TLC-kit om THC, CBD en CBN te kunnen kwantificeren.
Materialen en methoden
GC-FID-omstandigheden: 50 mg gedroogde en gehomogeniseerde bloeiwijzen werden geëxtraheerd met 2000 μl van een 9:1 methanol:chloroform mengsel en 0,2 g/l fenantreen en de monsters werden gedurende 15 minuten gesoniseerd in een ultrasoon bad. Een hoeveelheid van 200 μl van de extractie werd overgebracht naar een chromatografieflesje met 1000 μl methanol. Het cannabinoïdegehalte werd geanalyseerd in een GC met FID-detector. De kwantificering werd uitgevoerd met behulp van een ijkcurve die werd geconstrueerd met behulp van de verhouding van de gebieden tussen de interne standaard en verschillende concentraties cannabinoïdenreferentiestandaarden. Voor de kalibratie werd CBN gebruikt in plaats van THC (Poortman van Der Meer et al, 1999). Met de methode is het mogelijk de cannabinoïden CBD, CBC, THC, CBG en CBN goed van elkaar te scheiden.
Graph 1: alpha-CAT results
Alpha-CAT-omstandigheden: 100 mg gedroogde en gehomogeniseerde bloeiwijzen werden gedurende 2 minuten geëxtraheerd met een oplosmiddelenmengsel dat "testvloeistof" zal worden genoemd en werd met een capillair buisje van 2 μl overgebracht op een 5x10 cm plaat die vooraf was gecoat met silicagel (TLC F254). Decarboxylering werd bereikt bij 150 °C gedurende 40 seconden met behulp van het verwarmingsapparaat en uitlijngereedschap van alpha-CAT. De platen werden ontwikkeld en gekleurd met Fast Blue B-zoutkleurstof. Kwantificering vond plaats door het aflezen van de overeenkomstige cannabinoïdepercentages met behulp van alpha-CAT cannabinoïdemeetlatten. (zie afbeelding 1).
Voor deze vergelijkende studie werden vier gehomogeniseerde batches van verschillende cannabisvariëteiten gebruikt. Drie monsters van elke batch werden geanalyseerd met TLC en drie met GC/FID. De laboratoriumprocedures werden uitgevoerd op de CF-locatie en de TLC-resultaten werden blind getest, uitgevoerd door plaatbeeldscans via email te verzenden naar het alpha-CAT laboratoriumhoofdkwartier voor cannabinoïde-kwantificering door alpha-CAT te lezen met de corresponderende cannabinoïdemeetlatten.
Afbeelding 1: alpha-CAT-densitometriemethode, met gebruik van van alpha-CAT cannabinoïde-kalibratie-%
Discussie
De gemiddelde percentages van elk monster werden vergeleken. Verschillen tussen 15,40% en 48,82% werden gedetecteerd bij het kwantificeren van THC en 34,25% bij het kwantificeren van CBD bij het vergelijken van de twee methoden. De verhouding THC:CBD was proportioneel vergelijkbaar (zie grafiek 2). Toen CBD en CBN onder de 1% zaten, was er een incoherentie wat betreft kwantificering, ook al werden ze correct gedetecteerd. Dit was de eerste direct vergelijkende studie tussen GC-FID en het TLC alpha-CAT protocol.
Afbeelding 2: Identificatie en kwantificeringspieken GC-FID-cannabinoïden
De testmethode van Alpha-CAT heeft bewezen een geldig kwalitatief instrument te zijn voor de detectie van cannabinoïden en geeft reproduceerbare resultaten. Maar, alleen technisch personeel met een goede training in het gebruik van de kitmethode van alpha-CAT is in staat semi-kwantitatieve resultaten te verkrijgen met gebruik van de alpha-CAT cannabinoïdemeetlatten. Voor een nauwkeurige kwantificering van de cannabinoïden en andere belangrijke secundaire werkzame stoffen in cannabis moet een gas- of vloeistofchromatografische analyse worden gebruikt.
Grafiek 2: GC-FIC-resultaten
Referentielijst
- Igor Grant, Hampton Atkinson, Ben Gouaux, and Barth Wilsey. Medical Marijuana: Clearing Away the Smoke. Open Neurol J. 2012; 6: p. 18–25.
- Galand N, Ernouf D, Montigny F. Separation and identification of Cannabis components by different planar chromatography techniques (TLC, AMD, OPLC). J Chromatogr Sci. 2004 Mar; 42(3) : p.130-134.
- Steve Kilts, vice president of CannLab, Denver, CO, USA. Industry Needs to Start Taking Medical Cannabis Testing, Labeling Seriously. Medical Marijuana Business Daily, www.mmjbusinessdaily.com, 2nd of October 2012.
- Justin T Fischedick, Ronald Glas, Arno Hazekamp, Rob Verpoorte. A qualitative and quantitative HPTLC densitometry method for the analysis of cannabinoids in Cannabis sativa L. Phytochem Anal. 2009; 20(5): p.421-426.
- P. B. Baker, T. A. Gough, B. J. Taylor. Illicitly imported Cannabis products: some physical and chemical features indicative of their origin. Bulletin UNODC. 1980, p.31-40.
- Laboratory and Scientific Section UNODC, Recommended Methods for the Identification and Analysis of Cannabis and Cannabis Products, United Nations, publications 2009, p.36-39.
- Poortman-van der Meer, A.J. and Huizer, H. A contribution to the improvement of accuracy in the quantitation of THC. Forensic Sci int 1999. 101, 1-8
