Po objevu virů v pozdějších letech 19. století vedli biologové a filozofové téměř 100 let debatu o tom, zda jsou viry nejmenší známou formou života.
Viry, které se spoléhají na přísně parazitický životní cyklus, mohou infikovat živočichy, rostliny, houby a bakterie. Šíří se z jedné hostitelské buňky na druhou a z jednoho hostitelského organismu na druhý, a dokonce i napříč druhy; jsou schopny morfovat a vyvíjet se, aby zvýšily svou šanci na vytvoření další generace.
Po mnoho let byly viry považovány za paradigma DNA/RNA naprogramované pro vlastní přežití. Surový a účinný virus "nese" a replikuje velmi malý fragment genetického materiálu, až 3500 nukleotidů (bakteriofág MS2), nezbytný ke kódování proteinů (často enzymů) potřebných k podmanění hostitelského buněčného metabolismu, infikování okolních buněk a replikaci viru, čímž hostitelskou buňku zničí.
Skutečné porozumění genomům a metabolismu virů začalo v 50. letech a postupovalo velkou rychlostí. Dnes mohou vědci s viry manipulovat v jemné míře: genomy jsou zakódovány na požádání a život viru řídí vědci jako loutkář loutku.
Jedinou jistotu, kterou vědci ztratili, jedinou drobnou vadu filozofické debaty z prvních desetiletí 20. století, je to, že i kdyby se viry daly považovat za formy života, nejsou nejmenšími známými. Theodor O. Diener (US Department of Agriculture, Beltsville, Maryland, USA) objevil v roce 1971 první viroid, původce onemocnění postihujícího vřetenovku bramborovou. Ukázal, že původce je volná RNA o 359 nukleotidech, která je příliš malá na to, aby obsahovala genetickou informaci potřebnou pro vlastní replikaci, a není schopna syntetizovat obal.
VIROIDY
Viroidy, nejmenší známí infekční agens, patří do nového řádu subvirových agens, který v současnosti zahrnuje dvě čeledi, osm rodů a 32 druhů viroidů. Viry a viroidy, které přidávají do mikroskopického světa další vrstvu složitosti, by se neměly vzájemně zaměňovat.
Pokud jsme ochotni hledat analogie, lze viry označit za "buněčné hackery". Po vpravení svého genetického materiálu viry převezmou buněčný stroj, začnou syntetizovat vlastní enzymy a proteiny a vyvolávají jak sebereplikaci, tak infekci okolních buněk. Tito prapůvodní hackeři jsou dobře chráněni kapsidou, zpevněným obalem z proteinů, který je zodpovědný za specifičnost viru. Kapsidy dávají virům jejich pozorovatelný tvar, jsou vektory virů při jejich migraci v organismech a fungují jako senzory pro specifické buněčné membrány označené jako cíle. Uvnitř kapsidy je skutečný infikující algoritmus zakódován jako DNA/RNA, podobně jako nabitá zbraň.
Viroidy jsou jiné. Viroidy jsou měňavci. Viroidy, charakterizované a tvarované pouze svým genetickým materiálem (RNA), jsou holé struktury interagující s prostředím. Povaha, orientace a síla interakce s okolními sloučeninami může modifikovat geometrii viroidu, který se může přizpůsobit velkému množství chemických prostředí.
S méně než 1/10 celkových RNA-nukleobází viru nekódují viroidní sekvence proteiny ani enzymy. Genetický materiál viroidu je sestaven tak, aby byl paspartou: je schopen se kroutit, natahovat, ohýbat a reverzibilně štěpit. Klíčem k pochopení replikace viroidů je přijmout fakt, že chaotická harmonie, která definuje buněčnou biologii, je narušena jedinou strukturou.
Vd-RNA je krátký kruhový fragment o délce asi 246-401 nukleotidů s velmi vysokým stupněm párování bází. Prodleva mezi infekcí rostliny a objevením se viditelných příznaků charakterizuje životní cyklus některých viroidů, které proto propůjčují svá jména tomuto stavu.
Příkladem takového chování a hlavním tématem této kapitoly je latentní viroid chmele, prvek z čeledi Pospiviroidae a rodu Cocadviroid.
HLVd
Obr. 1: Původní stabilní termodynamické schéma HLV, jak bylo publikováno v časopise Nucleic Acids research v roce 1988.
HLVd se skládá z jednovláknového polymeru o 256 nukleotidech, které zaujímají tyčinkovitou strukturu s 65,5 % stupněm párování bází. Jak bylo představeno v předchozí kapitole, HLVd se vyznačuje jemnou infekcí chmelem, jak napovídá název, a konopím. Latentní viroid chmele vyvolává imunitní reakci, která vede k nekróze, žloutnutí a odumírání buněk.
Pozorování a charakterizace HLVd v konopí je stará jen několik let a připisuje se Grahamu Farrarovi ze společnosti Glass House Farms, přičemž vědecké důkazy vypracovala Kalifornská univerzita v Davisu ve spolupráci se společností Phylos Bioscience (jako soukromým partnerem). V roce 2017 byly příznaky HLVd poprvé zaznamenány v Kalifornii a viroid se nyní nachází v Kanadě. Rostliny mohou být latentními asymptomatickými přenašeči.
Příznaky HLVd
Rostlina s HLVd vykazuje soubor zvláštních příznaků: zpomalení růstu, křehké stonky, slabé kvetení a exprese sekundárních struktur a metabolitů a malformace a/nebo chloróza listů, bez zjevné příčiny.
Latentní období mezi infekcí rostliny a objevením se prvních příznaků nelze připsat jedinému určujícímu faktoru a může se u různých chemotypů značně lišit.
Zdá se, že údaje získané z různých studií naznačují, že mladí jedinci jsou efektivnější v rozpoznávání/bojování s cizími fragmenty RNA jako viroidy, což vytváří zpoždění, které racionálně označujeme jako latenci.
Studie kolem HLVd nám pomalu dávají vysvětlení pro dudding a protokoly a řešení pro zmírnění celosvětového šíření patogenu.
Za prvé: dudding mění poměr růstu/obrany napadených rostlin, což znamená všeobecné zpoždění v době růstu a setrvačnost vůči úpravám růstových podmínek. Tento poslední účinek zahrnuje reakce na živiny, přísady a fotoperiodu.
Druhý a stále více znepokojující účinek se týká primárních a sekundárních struktur, jako jsou květy/plody a chlupy/kolíky. U rostlin konopí infikovaných HLVd to znamená drastické snížení počtu trichomů a malformaci zbývajících trichomů do podoby suchých chlupů. Účinky infekce na moderní porosty konopí nejsou potvrzeny, ale odhadují se na 30 až 80 % ztráty na výnosu infikovaných jednotek. Toto číslo není zmírněno existencí léku pro živé rostliny; HLVd infikované jedince jsou okamžitě zničeny.
Vědci s vědomím nebezpečí, které infikovaný organismus představuje, vyvíjejí techniky boje proti viroidu na buněčné úrovni a mohou z infikovaného hostitele vytvořit zdravé potomstvo pomocí různých technik, jako je termoterapie, chladová terapie, tkáňové kultury, mikrograftování in vitro nebo kryoterapie, v závislosti na konkrétním páru viroid-hostitel.
Přenos a bezpečnostní opatření
Získání čistého genetického materiálu z kontaminovaných vzorků je obtížnější, než se může zdát: HLVd může přežívat dlouhou dobu mimo pohodlí živých buněk a bylo prokázáno, že mrtvé tkáně mohou šířit onemocnění.
Riziko obětování velké části pěstované populace je dostatečně děsivé, aby se doporučily přísné hygienické protokoly. Používání sterilního vnitřního prostředí, jednopoužití rukavic a nástrojů a řádná biologická izolace rostlin konopí jsou doporučovány celou vědeckou komunitou od počátku renesance konopí, ale nadcházející hrozby promění toto doporučení v povinný prvek. Desetiprocentní bělicí roztok nebo sterilizace Bunsenovým hořákem/plamenem jsou konzervativní způsoby, jak zabránit/vyhnout se nákaze prostřednictvím opakovaně použitelných nástrojů, což omezuje výdaje ve vztahu k materiálům na jedno použití.
Šíření HLVd v konopí prostřednictvím osiva je méně časté, ale zatím ho nelze vyloučit. Semena je třeba považovat za malé "trezory" pro struktury DNA a patří k nejnáročnějším prostředím pro cizorodý genetický materiál, což brání kumulaci patogenu. Na vnější straně semen se stále mohou nacházet zbytky a jiné fragmenty, které mohou působit jako vektory viroidů; pro další snížení rizika se doporučuje ohleduplné ošetření (omytí).
Zdá se, že studie HLVd na chmelu vylučují nákazu prostřednictvím hmyzu, ale údaje o variantách konopí je třeba teprve prokázat.
Malí soukromí pěstitelé by se měli cítit relativně chráněni: čisté vnitřní prostory, často obývané méně než 10 jedinci, vybranými z několika desítek naklíčených semen nebo odřezků, mají tendenci minimalizovat rizika nákazy jak z rostliny na rostlinu, tak z nástroje na rostlinu.
Ve větším měřítku je rozdělení pěstebních ploch na menší jednotky a omezení/registrace přístupových míst do/ze pěstebních/pracovních prostor radou GMP (pravidla správné výrobní praxe), kterou bychom neměli přehlížet.
Stejně jako u mnoha jiných patogenů je nejlepším způsobem, jak zajistit rychlou reakci na HLVd, solidní analytický program. Laboratoře po celém světě jsou připraveny identifikovat a dokonce sekvenovat HLVd a další viroidy/viry pomocí rutinních technik za konkurenceschopné ceny.
V nabídce pro komerční vzorky dominuje PCR s reverzní transkripcí (RNA polymerázová řetězová reakce). Tato technika amplifikuje sekvence RNA ve vzorku a po několika průchodech identifikuje známé fragmenty (viroidní sekvence a fragmenty) s vysokou přesností, což umožňuje včasnou diagnózu.
Možností je také sekvenování RNA: amplifikuje se celý materiál RNA nalezený v buňkách, přirozené fragmenty se vyřadí a zbývající se podrobně analyzují.
Ceny laboratoří třetích stran se rychle snižují, ale stejné techniky lze provádět i ve vlastních laboratořích na specifických přístrojích.
I když mají vědci k dispozici jen několik málo robustních metod, vyvíjejí mnoho nových různých technik, které urychlují a zjednodušují detekci HLVd v masovém měřítku. V každém případě může být zapotřebí předložení více vzorků na jednu rostlinu, aby bylo možné s jistotou určit, že rostlina neobsahuje viroidy.
Pro účinnou diagnostiku rostliny prosté choroby doporučují některé laboratoře minimálně 3-4 testy na rostlinu, přičemž jednotlivé testy by měly být provedeny s odstupem 1-2 týdnů.
Pěstitelé musí být obzvláště opatrní u zásobních rostlin. Obecně platí, že tyto vzorky je třeba zaslat přes noc a v ledu.
Pokud je zařízení pozitivní na HLVd, lze vybrané genetické rostliny ještě zachránit. Laboratoře/společnosti vyvinuly vlastní patentovanou techniku pro boj s akumulací viroidů ve specifických tkáních.
K vyčištění vzorku se obvykle používá tepelné a/nebo chladové ošetření meristémů nebo uzlinových tkáňových kultur. Vyčištěné buňky rostlinných tkání se pak pěstují na specializovaných růstových médiích a množí se tak, aby vznikly zakořeněné výhonky bez chorob, označované jako "plantlety" (známé také jako mikropropagace).
Největší nevýhodou těchto postupů je cena, která může dosahovat tisíců dolarů.
Závěry
Viry a viroidy, jako je HLVd, nepřestanou existovat jen proto, že se konopné prostředí zaměřuje na populárnější témata. Organizace Fundación CANNA si je vědoma rizik spojených s HLVd, která se objeví, až se patogen rozšíří v důsledku globalizace a nelegálních praktik, a již na ně reagovala.
Požádejte o pomoc na info@fundacion-canna.com!
Bibliografie a uznání
Zvláštní poděkování patří Abha Guptovi, zahradníkovi, za skvělou podporu při konečné formulaci tohoto článku.
Gergerich, R. C. a V. V. Dolja. Introduction to Plant Viruses, the Invisible Foe (Úvod k rostlinným virům, neviditelný nepřítel). The Plant Health Instructor. 2006 DOI: 10.1094/PHI-I-2006-0414-01
Patzak, J.; Henychová, A.;Krofta, K.; Svoboda, P.; Malíˇrová, I. The Influence of Hop Latent Viroid (HLVd) Infection on Gene Expression and Secondary Metabolite Contents in Hop (Humulus lupulus L.) Glandular Trichomes. Plants 2021, 10, 2297. https://doi.org/10.3390/plants10112297
Holger Puchta, Karla Ramm a Heinz L.Sanger. Molekulární struktura latentního viroidu chmele (HLVd), nového viroidu vyskytujícího se celosvětově ve chmelu; Accession no. X07397 Max-Planck-Institut fuir Biochemie, 18. dubna 1988.
Marina Barba, Zhibo Zhang. Viroid Elimination by Thermotherapy, Cold Therapy, Tissue Culture, In Vitro Micrografting, or Cryotherapy:, in Viroids and Satellites, 2017 (Eliminace viroidů pomocí termoterapie, studené terapie, tkáňových kultur, in vitro mikrotransplantace nebo kryoterapie).
