Na de ontdekking van virussen aan het einde van de 19e eeuw, hebben biologen en filosofen bijna 100 jaar lang gedebatteerd of dit de allerkleinste levensvorm was die de mensheid kende.
Virussen hebben een volledig parasitaire levenscyclus en zijn in staat om dieren, planten, schimmels en bacteriën te infecteren. Ze verspreiden zich van de ene gastheercel naar de andere, en van het ene gastheerorganisme naar het andere, en kunnen zelfs overstappen naar een volledig andere soort; ze kunnen ook van gedaante veranderen en evolueren, om zo hun kans te vergroten om de volgende generatie te generen.
Virussen zijn jarenlang beschouwd als het paradigma van DNA/RNA dat geprogrammeerd was voor hun eigen overleving. Het virus is rudimentair en effectief, en "draagt" en vermenigvuldigt een heel klein fragment genetisch materiaal, zo klein als 3500 nucleotiden (Bacteriofaag MS2), dat nodig is om de eiwitten te coderen (vaak enzymen) die het cellulaire metabolisme van de gastheer onderdrukken, nabijgelegen cellen infecteren, en het virus vermenigvuldigen, waarbij de gastheercel zelfs gedood kan worden.
In de jaren '50 gingen wetenschappers de virus-genomen en hun metabolisme steeds beter begrijpen en nam onze kennis over virussen snel toe. Tegenwoordig kunnen wetenschappers virussen in hoge mate manipuleren: de genomen worden op verzoek gecodeerd en het leven van het virus wordt bestuurd door wetenschappers zoals een poppenspeler een marionet bespeelt.
De enige zekerheid die wetenschappers hebben moeten inleveren, en de enige kleine fout in het filosofische debat uit de eerste decennia van de 20e eeuw, is dat zelfs als we virussen als een levensvorm zouden beschouwen, het toch niet de allerkleinste levensvormen zijn. Theodor O. Diener, een plantenpatholoog die werkzaam was bij het Amerikaanse Ministerie van Landbouw in Maryland, VS, ontdekte in 1971 de eerste viroïde, de ziekteverwekker van de aardappelknolziekte. Hij toonde aan dat de viroïde bestaat uit korte enkelstrengs-RNA met 359 nucleotiden. Deze zijn te klein om de genetische informatie te bevatten die nodig is voor zelfvermenigvuldiging. Ook is de viroïde niet in staat om een omhulsel te synthetiseren. Bovendien kunnen viroïden zich alleen in planten vermenigvuldigen.
VIROIDEN
Viroïden, de kleinste bekende infectieuze agentia, behoren tot de nieuwe orde van subvirale agentia, die momenteel bestaat uit twee families, acht geslachten en 32 soorten viroïden. Deze ontdekking voegt een nieuwe laag complexiteit toe aan de microscopische wereld, maar we mogen virussen en viroïden niet met elkaar verwarren.
Ale we een analogie willen gebruiken, kunnen we virussen omschrijven als 'cel-hackers'. Na het injecteren van hun genetisch materiaal nemen virussen het cellulaire systeem over. Ze beginnen hun eigen enzymen en eiwitten te synthetiseren en veroorzaken zowel hun eigen vermenigvuldiging als infectie in nabijgelegen cellen. Deze voorouderlijke hackers worden goed beschermd door een capside, een geharde eitwitmantel die het virus zijn kenmerken geeft. Capsiden geven virussen hun waarneembare vorm. Ze helpen virussen tijdens hun migratie in organismen en fungeren als sensoren voor specifieke celmembranen die als doelwitten worden geïdentificeerd. Het echte infecterende algoritme wordt gecodeerd als DNA/RNA in de capside, waar het klaar ligt voor de aanval, als een geladen vuurwapen.
Viroïden zijn heel anders. Viroïden zijn shapeshifters of gedaanteverwisselaars. Ze worden slechts gekenmerkt en gevormd door hun genetische materialen (RNA). Viroïden zijn naakte structuren die reageren op hun omgeving. De aard, oriëntatie en sterkte van deze interactie met nabijgelegen verbindingen kunnen de vorm van de viroïde veranderen. Deze kan zich aanpassen aan een groot aantal chemische omgevingen.
Met minder dan 1/10 van de totale RNA-nucleobasen van een virus, zijn viroïdensequenties niet in staat om te coderen voor eiwitten of enzymen. Het genetische materiaal van een viroïde wordt vaak vergeleken met een passe-partout: het kan draaien, rekken, buigen en omkeerbaar gesplitst worden. Om de vermenigvuldiging van viroïden te begrijpen is het essentieel om te accepteren dat de chaotische harmonie die de cellulaire biologie definieert, wordt verstoord door een enkele structuur.
Vd-RNA is een kort circulair fragment van ongeveer 246-401 nucleotiden, met een zeer hoge graad van basenparing. De vertraging tussen de besmetting van de plant en het verschijnen van zichtbare symptomen kenmerkt de levenscyclus van sommige viroïden, die daarom hun naam aan de aandoening verlenen.
Een voorbeeld van dit gedrag, en het onderwerp van dit hoofdstuk, is de hoplatente viroïde, een element van de Pospiviroidae-familie en het geslacht Cocadviroid.
HLVd
Fig.1: Origineel stabiel thermodynamisch overzicht van HLV, zoals gepubliceerd in onderzoek over nucleïnezuren in 1988
HLVd bestaat uit een enkel-strengs polymeer van 256 nucleotiden die een staafachtige structuur aannemen met 65,5% basenparen. Zoals beschreven in een eerder hoofdstuk, wordt HLVd gekenmerkt door een subtiele infectie van hop, zoals de naam hoplatente viroïde al doet vermoeden, en cannabis. Hoplatente viroïde veroorzaakt een immuunrespons die leidt tot necrose, vergeling en celdood.
De waarneming en beschrijving van HLVd in cannabis is slechts een paar jaar oud en wordt toegeschreven aan Graham Farrar van Glass House Farms met wetenschappelijk bewijs van de University of California Davis, in samenwerking met Phylos Bioscience (als privépartner). In 2017 werden de HLVd-symptomen voor het eerst opgemerkt in Californië. De viroïde is inmiddels ook in Canada aangetroffen. Planten kunnen latente asymptomatische dragers zijn.
HLVd-symptomen
Een plant met HLVd vertoont een reeks vreemde symptomen: groeiachterstand, broze stengels, slechte bloei en de expressie van secundaire structuren en metabolieten, en misvorming en/of chlorose (geel-geelgroene verkleuring) van de bladeren, zonder aanwijsbare oorzaak.
De latentietijd tussen de infectie van de plant en het verschijnen van de eerste symptomen kan niet worden toegeschreven aan één bepalende factor en verschilt ook enorm tussen verschillende chemotypes.
Gegevens uit verschillende onderzoeken lijken erop te wijzen dat jonge individuen efficiënter zijn in het herkennen/bestrijden van vreemde RNA-fragmenten als viroïden, wat de vertraging genereert die we als latentie definiëren.
Studies over HLVd geven ons steeds meer een verklaring voor 'dudding' (aanzienlijke beperking van de groei en bloei van de plant), en protocollen en oplossingen om de wereldwijde verspreiding van de ziekteverwekker te bestrijden.
Ten eerste: dudding verandert de groei/afweerverhouding van de geïnfecteerde planten, waardoor er een algemene vertraging in de groeitijden ontstaat en de plant zich ook langzamer aanpast aan veranderingen in de groeiomstandigheden. Dit laatste effect heeft betrekking op hoe de plant reageert op voedingsstoffen, additieven en fotoperiode.
Het tweede, en steeds zorgwekkendere, effect is op primaire en secundaire structuren zoals bloemen/vruchten en haren/stekels. Voor HLVd-geïnfecteerde cannabisplanten betekent dit een drastische vermindering van het aantal trichomen en de misvorming van de resterende trichomen die veranderen in droge haarachtige structuren. De effecten van de infectie op moderne cannabisgewassen zijn niet bevestigd, maar worden geschat op 30% tot 80% verlies in de opbrengsten van de geïnfecteerde planten. Een remedie voor levende planten zal weinig afdoen aan deze cijfers; planten die geïnfecteerd zijn met HLVd worden onmiddellijk vernietigd.
Wetenschappers kennen de gevaren van de infecterende stof en zijn technieken aan het ontwikkelen om de viroïde op cellulair niveau te bestrijden en een gezond nageslacht te kunnen genereren van een geïnfecteerde gastheer door toepassing van verschillende technieken zoals thermotherapie, koudetherapie, weefselkweek, in vitro microtransplantatie of cryotherapie, afhankelijk van het specifieke viroïde-gastheerpaar.
Overdracht en voorzorgsmaatregelen
Het terugwinnen van onbesmet en onaangetast genetisch materiaal uit besmette planten is moeilijker dan het klinkt: HLVd kan lange tijd overleven buiten het comfort van levende cellen. Inmiddels is ook bewezen dat dode weefsels de ziekte verspreiden.
Het vooruitzicht dat we een groot deel van de volwassen planten moeten opofferen is zo'n angstaanjagend scenario dat we zeer strenge hygiënische protocollen aanbevelen. Een steriele binnenruimte, het gebruik van wegwerphandschoenen en -gereedschap en de juiste biologische isolatie van cannabisplanten wordt sinds het begin van de cannabisrenaissance door de hele wetenschappelijke gemeenschap aanbevolen, maar de komende bedreigingen zullen deze aanbeveling veranderen in een vereiste. Een 10% bleekmiddeloplossing of bunsenbrander/vlamsterilisatie zijn conservatieve manieren om besmetting via herbruikbare gereedschappen te voorkomen of te vermijden, waardoor de kosten van wegwerpmateriaal kunnen worden beperkt.
HLVd-verspreiding in cannabis via zaad komt minder vaak voor, maar kan nog niet worden uitgesloten. Zaden moeten worden gezien als kleine "kluisjes" voor DNA-structuren en behoren tot de meest onherbergzame leefomgevingen voor vreemd genetisch materiaal, waardoor de accumulatie van de ziekteverwekker wordt voorkomen. De buitenkant van zaden kan nog steeds gruis en andere fragmenten bevatten die als vectoren voor viroïden kunnen fungeren; een zorgvuldige behandeling (wassen) wordt geadviseerd om het risico verder te verminderen.
Studies naar HLVd bij hop lijken besmetting via insecten uit te sluiten, maar de gegevens over cannabisvarianten moeten nog worden bewezen.
Kleine particuliere telers kunnen zich relatief beschermd voelen: schone binnenruimtes, vaak met minder dan 10 planten, zorgvuldig geselecteerd uit enkele tientallen ontkiemde zaden of stekjes, lijken de risico's van besmetting van plant tot plant en van gereedschap tot plant te beperken.
Op grotere schaal is de versnippering van teeltgebieden in kleinere eenheden en het beperken/registreren van iedereen die de toegangspunten tot teelt-/werkruimten betreedt en verlaat een GMP-advies (Good Manufacture Practice rule) die niet over het hoofd mag worden gezien.
Zoals voor veel andere pathogenen, is een robuust analytisch programma de beste manier voor een snelle aanpak van HLVd. Laboratoria over de hele wereld staan klaar om HLVd en andere viroïden/virussen te identificeren en zelfs de sequentie in kaart te brengen met erkende technieken tegen concurrerende prijzen.
Omgekeerde transcriptie PCR (RNA Polymerase Chain Reaction) is de meest voorkomende test voor commerciële monsters. De techniek versterkt de RNA-sequenties in het monster en identificeert bekende fragmenten (viroïde-sequenties en -fragmenten) met hoge graad van nauwkeurigheid. Hierdoor is een vroegtijdige diagnose mogelijk.
RNA-sequencing is ook een optie: het volledige RNA-materiaal dat in de cellen wordt gevonden, wordt uitvergroot, natuurlijke fragmenten worden genegeerd en de resterende fragmenten worden zorgvuldig geanalyseerd.
De prijzen voor tests bij particuliere labs dalen snel, maar dezelfde technieken kunnen ook intern worden uitgevoerd, met speciale apparatuur.
Zelfs met weinig robuuste methoden tot hun beschikking, ontwikkelen wetenschappers veel nieuwe technieken om de detectie van HLVd op grote schaal te versnellen en te vereenvoudigen. Het kan zijn dat er meerdere monsterinzendingen per plant nodig zijn om te bevestigen dat de plant viroïdenvrij is.
Om een ziektevrije plant effectief te diagnosticeren, raden sommige laboratoria minimaal 3-4 tests per plant aan, met een interval van 1-2 weken tussen elke test.
Kwekers moeten vooral voorzichtig zijn met stamplanten. Over het algemeen moeten deze monsters met een expreskoerier (levering binnen 24 uur), gekoeld (met een ice-pack) worden verzonden.
Als een instelling positief is getest op HLVd, is het misschien nog mogelijk om de geselecteerde genetica te redden. Labs/bedrijven hebben hun eigen gepatenteerde techniek ontwikkeld om de ophoping van viroïden in specifieke weefsels te bestrijden.
Warmte- en/of koudebehandelingen worden over het algemeen gebruikt op een meristeem- of knoopweefselkweek om het monster te reinigen. Gereinigde plantenweefselcellen worden vervolgens gekweekt op gespecialiseerde groeimedia om ziektevrije scheuten met wortel te kweken die "plantjes" of plantlets worden genoemd (ook bekend als microvermeerdering).
Het grootste nadeel van deze procedures is de prijs, die kan oplopen tot duizenden dollars or euro's.
Conclusies
Virussen en viroïden, zoals HLVd, zullen niet ophouden te bestaan alleen omdat de cannabisomgeving zich op interessantere onderwerpen richt. Fundación CANNA is zich zeer bewust van de hLVd-risico's die zullen ontstaan wanneer globalisering en illegale praktijken deze ziekteverwekker verder zullen verspreiden. We hebben ons inmiddels hierop voorbereid en staan klaar met een aanpak.
Vraag info@fundacion-canna.com om hulp!
Literatuurlijst en dankbetuiging
Speciale dank aan Abha Gupta, een kweker, voor zijn geweldige steun bij het schrijven van dit artikel.
Gergerich, R.C., and V. V. Dolja. Introduction to Plant Viruses, the Invisible Foe. The Plant Health Instructor. 2006 DOI: 10.1094/PHI-I-2006-0414-01
Patzak, J.; Henychová, A.;Krofta, K.; Svoboda, P.; Malíˇrová, I. The Influence of Hop Latent Viroid (HLVd) Infection on Gene Expression and Secondary Metabolite Contents in Hop (Humulus lupulus L.) Glandular Trichomes. Plants 2021, 10, 2297. https://doi.org/10.3390/plants10112297
Holger Puchta, Karla Ramm and Heinz L.Sanger. The molecular structure of hop latent viroid (HLVd), a new viroid occurring worldwide in hops; Accession no. X07397 Max-Planck-Institut fuir Biochemie, April 18, 1988
Marina Barba, Zhibo Zhang. Viroid Elimination by Thermotherapy, Cold Therapy, Tissue Culture, In Vitro Micrografting, or Cryotherapy:, in Viroids and Satellites, 2017
